Vascular Endothelial Growth Factor ( VEGF )

Vascular endothelial growth factor (VEGF) adalah glikoprotein proangiogenik yang berfungsi meningkatkan proliferasi, migrasi, survival pada sel endotel serta meningkatkan permeabilitas kapiler.(9,14)Sel  kita memerlukan oksigen,yang digunakan sebagai energi menjalankan proses proses molekuler. Oksigen tersebut dikirimkan melalui darah, dan sebagian besar sel sel kita berada dalam rentang 10 milimeter dari pembuluh kapiler.Sel sel tumor juga tanpa pengecualian.Bila massa sel sel tumor telah lebih besar dari 1 milimeter, hal tersebut menyebabkan sel kekurangan oksigen dan energi kecuali dibentuk pembuluh darah baru.(12,14)Vascular endothelial growth factor atau  VEGF adalah sinyal kunci yang digunakan oleh sel yang kekurangan oksigen (oxygen-hungry cells) untuk memicu pertumbuhan pembuluh darah.(11 )

Biologi Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF )
Perkembangan pembuluh darah  adalah kebutuhan utama dalam perkembangan dan diferensiasi organ selama embriogenesis, demikian juga pada penyembuhan luka serta fungsi reproduksi pada manusia dewasa. Angiogenesis juga terlibat dalam patogenesis berbagai penyakit  seperti retinopati proliferatif, arthtitis rheumatoid, termasuk pertumbuhan tumor.

 Struktur VEGF dan Reseptor VEGF
VEGF pertama kali dideskripsikan sebagai protein yang mampu merangsang permeabilitas vaskuler dan proliferasi sel endotel dan diidentifikasi sebagai perangsang utama angiogenesis dan vaskulogenesis. (33,34) VEGF adalah sebuah basa, 34-46-kDa homodimeric, heparin-binding glycoprotein dan  gen VEGF berada di kromosom 6p12. VEGF, yang juga disebut VEGF-A atau vascular permeability factor(VPF),termasuk kedalam keluarga supergene VEGF-platelet-derived growth factor (PDGF). Anggota keluarga yang lain adalah VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D dan VEGF-E. Semua menunjukkan derajat yang bervariasi homolog dengan VEGF.Splicing alternatif gen VEGF menghasilkan empat asam amino isoform 121, 165, 189 dan 206 serta varian-varian lain yang lebih jarang. VEGF-165, adalah bentuk dominan dan sebagian terkait dan disekresi oleh matriks. ( 13,14,46)
VEGF-189 dan VEGF-206 merupakan dasar, dengan afinitas tinggi terhadap heparin  dan tetap terkucil dalam matriks ekstra-selular, terikat pada proteoglikan-proteoglikan heparan sulfat. VEGF-121 bersifat asam, tidak mengikat heparin dan disekresikan. Bentuk matriks sekuester mungkin dilepaskan oleh kerja enzimatik, baik melalui kerja heparinase atau melalui celah plasmin untuk melepaskan suatu fragmen yang bersifat difusif (VEGF-110).Kerja VEGF-165 terkait dengan aktivasi kaskade proteinase, termasuk yang mengarah kepada pembentukan plasmin, sehingga penglepasan isoform VEGF yang terikat matriks menimbulkan mekanisme amplifikasi.(12,14,46)

Regulasi Ekspresi VEGF
Ekspresi VEGF diatur oleh berbagai hormon, faktor pertumbuhan dan sitokin. Ekspresi mRNA VEGF meningkat pada kultur sel yang dirangsang dengan Interleukin-6 (IL-6), PDGF,EGF,TGF,prostaglandin E2, thyroid stimulating hormone (TSH) dan luteotrophic hormone.Sebagai tambahan,nitric oxide dan produk-produk onkogen v-Has-ras/v-raf  juga merangsang ekspresi VEGF.            Hipoksia merupakan rangsangan terkuat ekspresi VEGF baik pada in vitro maupun in vivo.VEGF gene promoters, mempunyai elemen cis-acting enhancer yang akan berikatan dengan hypoxiainducible factor (HIF),suatu faktor transkripsi. Dengan ikatan pada reseptor VEGF dan terjadi transauto-posporilirisasi dan aktifasi kaskade sinyal transduksi meliputi jalur Src,PLC-g,MAPK, STAT3 dan STAT5. (11)            Ekspresi gen VEGF diregulasi oleh suatu stimulasi pejamu, termasuk estrogen, nitric oxide (NO) dan berbagai variasi growth factor, diantaranya fibroblast growthfactor-4, PDGF, tumor necrosis factor alpha (TNF-α),epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor beta (TGF-β), keratinocyte growth factor, interleukin (IL)-6, IL-1β dan insulin-like growth factor-1 (IGF-1).           Konsisten dengan perannya pada angiogenesis tumor, ekspresi VEGF diregulasi oleh kejadian-kejadian genetik yang biasa terjadi pada transformasi maligna, seperti hilangnya gen-gen supresor tumor (misalnya p53) dan aktivasi onkogen sepertiras, v-src dan HER-2. Selebihnya ekspresi VEGF secara khusus lebih  sensitif terhadap tekanan oksigen dan sangat terpengaruh oleh hipoksia yang menjadi karakter hampir semua tumor.            Dengan VEGF, hipoksia juga menimbulkan regulasi VEGFR-1 dan VEGFR-2 pada sel-sel endotelial. Peningkatan ekspresi gen-gen VEGFR juga diinduksi oleh pengikatan kepada VEGF itu sendiri, sehingga menimbulkan amplifikasi sinyal VEGF. TGF-β, yang juga menimbulkan peningkatan VEGF, telah ditemukan menurunkan regulasi kadar VEGFR mRNA pada sel-sel endotelial, sedangkan TNF-α dilaporkan mempunyai efek positif dan negatif terhadap ekspresi VEGFR-2.

Reseptor VEGF
        Sinyal kunci yang  mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel, juga regenerasi dan remodeling jaringan dewasa, dilakukan melalui reseptor transmembran, dimana sebagian besar adalah reseptor tyrosin kinase.Reseptor VEGF, VEGFR adalah suatu resptor kelompok tirosin kinase.
Ligands VEGF menghantarkan efek angiogenik melalui ikatan yang spesifik dengan VEGF reseptor (VEGFR). Ikatan tersebut mengakibatkan perubahan konformasional pada rseptor berupa dimerisasi dan berlanjut dengan sinyal transduksi melalui domain tirosin kinase. Ada 3 reseptor primer dan 2 buah ko-reseptor yang akan mengikat VEGF dan keluarganya, yaitu VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 dan ko-reseptor Neuropilin-1 dan Neuropilin-2. Neuropilin tidak mempunyai domain/area intraseluler dan diduga meningkatkan afinitas VEGF pada reseptor primer. Bebarapa variasi afinitas ligaands pada reseptor dapat dilihat padagambar dibawah ini.
Reseptor transmembran vascular epithelial growth factor (VEGF) dan  ligands meliputi : VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), and VEGFR-3 (Flt-4), neuropilin-1, and neuropilin-2.
Ekspresi reseptor VEGF pada sel endotel berbeda diantara 3 jenis reseptor VEGFR-1, VEGFR-2 dan VEGF-3. VEGF-2 diekspresikan hampir pada semua sel endotel, sedangkan VEGFR-1 dan VEGFR-3 hanya diekspresikan pada pembuluh darah tertentu.

                 Sinyal trasduksi  dari ikatan VEGF pada reseptor VEGFR-2

  • VEGFR-1 : adalah glikoprotein transmembran berukuran 180 kDa, dan dapat terdeteksi ekspresinya pada hampir semua sel endotel. VEGFR-1 berperan sebagi reseptor dari VEGF, PLGF dan VEGF-B.VEGFR-1 adalah sinyal kunci untuk angiogenesis,terutama pada fase embriogenesis, tapi tidak banyak berperan pada angiogenesis patologis, misalnya pada pertumbuhan tumor.
  • VEGFR-2 : VEGFR-2 sebelumnya dinamakan KDR (kinase insert-domain containing receptor) flk-1(fetal liver kinase-1),disandi oleh gen yang berlokasi pada region 4q11-q13 , sebuah protein berukuran 230 kDa. Selama masa embrio, ekspresi  mRNA VEGFR-2 terdistribusi pada kapiler, pembuluh darah dan endokardium.VEGFR-2 meningkat ekspresinya dengan rangsangan hipoksia, dan berperan utama pada regulasi permeabilitas vaskuler.VEGFR-2 menghatarkan sinyal efek angiogenik meliputi :

1.      permeabilitas vaskuler mikro2.      proliferasi sel endotel3.     invasi4.      migrasi5.      survival

  • VEGFR-3 : Protein VEGFR-3 (FLT4) mengikat VEGF-C dan VEGF-D. VEGFR-3 merangsang limphangiogenesis dan hanya ditemukan pada sel endotel aluran limfe dewasa. Didapatkan peran VEGFR-3 dalam menjaga integritas vaskuler dengan memodulasi aktifitas VEGFR-2.
  • Neuropilin : NRP-1 dan NP-2 adalah suatu glikoprotein transmembran,terekspresi pada sel endotel pembuluh darah ataupun pembuluh darah pada tumor.Ikatan pada VEGF akan menyebabkan peningkatan migrasi sel endotel.NRP-1 dan NRP-2 keduanya adalah suatu protein reseptor transmembran yang berhubungan dengan regulasi proses angiogenesis. Reseptor neuropilin akan mengikat beberapa isoform dari VEGF meliputi : VEGF, VEGF-E,PIGF-2 dan VEGF-B. Penelitian terakhir mendapatkan bahwa reseptor NRP-2 juga berikatan dengan VEGF-C dan diekspresikan bersamaan dengan VEGFR-3 dan berperan dalam perkembangan saluran limfe.

Sintesis dan Aktifitas Biologis VEGFSintessa VEGF
Sintesa VEGF dipicu oleh berbagai faktor. Faktor perangsang utama adalah hipoksia jaringan / sel, sedangkan faktor lainya adalah berbagai sitokin (PDGF, EGF,IGF dll), Cox-2 serta berbagai onkogen.             Hipoksia akan menyebabkan ekspresi HIF-1α, suatu faktor transkripsi, dan akan masuk dalam inti sel. Selanjutkan terjadi ikatan denganhipoksia respon elemet (HRE) dan terjadi transkripsi gen VEGF. Kemudian terjadi sintesa m-RNA VEGF, terjadi translasi dan diproduksi protein VEGF dan berakhir denga disekresikanya VEGF.            Dilain pihak, dengan keadaan normal atau tidak adanya hipoksia maka akan terjadi supresi transkripsi gen VEGF dan degradasi m-RNA serta protein yang diproduksinya.

 Aktifitas Biologis VEGF

       VEGF menstimulasi migrasi dan proliferasi sel endotel pada arteri, vena dan kapiler dan merangsang angiogenesis baikin vitro ataupu in vivo. Demikian juga, VEGF meransang migrasi dari monosit dan makrofag yang mempunyai reseptor VEGFR-1 di permukaanya.       VEGF juga bersifat pro-survival factor yang merangsang ekspresi protein antiapoptosis Bcl-2 dan A1 pada sel endotel manusia. VEGF juga menyebabkan peningkatan permeabilitas kapiler.Kerja VEGF dimediasi melalui pengikatan kepada dua reseptor tirosin kinase yaitu VEGFR-1 (Flt-1) dan VEGFR-2 (KDR; bentuk murin-nya dikenal sebagai Flk-1). Reseptor-reseptor tersebut diaktivasi oleh VEGF dengan mencetuskan fosforilasi berbagai protein ynag aktif dalam kaskade transduksi sinyal. Anggota lain dari keluarga VEGF menunjukkan spesifisitas pengikatan reseptor yang berbeda, dimana VEGF-B dan Placental Growth Factor (PlGF) hanya mengikat dan mengaktivasi VEGFR-1. VEGF-C danVEGF-D mengikat reseptor ketiga, VEGFR-3 (Flt-4) dan melakukan mediasi limfangiogenesis dam memperlihatkan beberapa aktivitas terhadap VEGFR-2. VEGFR-1 dan 2 ditemukan pada permukaan sel-sel endotelial, dimana mereka mengikat VEGF dengan afinitas tinggi. Walau VEGFR-1 berafinitas lebih tinggi, VEGFR-1 dipercaya bekerja sebagai reseptor umpan, mempengaruhi modulasi availabilitas VEGF terhadap VEGFR-2, reseptor utama sinyal VEGF. Kerja modulator lebih lanjut diperluas dengan adanya bentuk larut air dari VEGFR-1, yang mengikat VEGF dan dapat menghambat mitogenesis yang diinduksi VEGF, sebagaimana neuropilin, reseptor untuk kolapsin/semaforin. Neuropilin-2 terikat pada VEGFR-1, sedangkan neuropilin-1 terikat pada VEGF-165 dan meningkatkan afinitas terhadap VEGFR-2.

 Metode pemeriksaan VEGF  

                      Pemeriksaan terhadap VEGF dapat dilakukan dengan berbagai metode, dan hal ini kadang menimbulkan kesulitan untuk mengevaluasi / membadingkan hasil dari berbagai pemeriksaan tersebut. Macam pemeriksaan yang dilakukan adalah :            – RT-PCR dan in-situ hybridisation   untuk evalausi ekspresi m-RNA VEGF            – Intra-tumoral protein            – Imunhistokimia            – Western Blotting dan            – ELISA            Pemeriksaan kadar VEGF pada plasma dan serum penderita mempunyai keuntungan karena lebih mudah dilakukan, namun harus diperhatikan bahwa kadar VEGF dalam sirkulasi dipengaruhi oleh VEGF yang disekresikan oleh platelet dan lekosit akibat proses normal pembekuan. Masalah ini diatasi dengan pengambilan sampel darah dan segera dilakukan sentrifugasi untuk pemisahan serum penderita.            Cheng WF, mendapatkan nilai tengah ( median ) protein VEGF intra-tumoral pada pasien kaker serviks adalah 180 pg/mg, sedangkan pada jaringan normal 0 pg/mg.Besar lesi > 4 cm dibanding < 4m ( 1030 dibanding 118 ).Invasi limfo-vaskuler dibanding tidak ( 568 dibanding 118 ) dan pasien dengan metastase KGB dibanding tanpa metastase KGB ( 795,5 dibanding 121 pg/mg) (16)                 Sedangkan over ekspresi VEGF didapatkan dari pemeriksaan imunohistokimia sebesar 10/20 ( 50%) pada kasus dengan metastase KGB, sedangkan tanpa metastase KGB sebesar 16/84 dengan P=0,002).Pemeriksaan yang dilakukan dengan RT-PCR untuk menilai m-RNA, menyimpulkan VEGF-C upregulated130 kali pada pasien kanker serviks dibanding pada serviks normal.            Sensitivitas pemeriksaan VEGF-C yang diartikan sebagai perbedaan konsentrasi yang dapat dideteksi pada pengenceran bertingkat adalah 12,8 pg/ml.Kadar VEGF-C adalah antara 54 – 647 pg/ml  dan kadar rata ratanya adalah 170 pg/ml. Tidak didapatkan interferensi dengan protein lain dalam serum yang dapat mempengaruhi spesifisitas pemeriksaan VEGF-C.